Pythium Hastalığı Nedir ? Ayrıntılı Anlatım !

Konu
Want create site? Find Free WordPress Themes and plugins.

Pythium‘un Kısa hikayesi ve tanımı

Pythium cinsi Pringsheim (1858) tarafından P. monospermum’ un  Pringsh. type species olarak tanımlanışı ile ortaya konmuştur. Bu cins Oomycetes sınıfı, Peronosporales takımı ve Pythiaceae familyasındadır. Taksonominin tarihsel evrimi için Middleton (1943)’ a başvurulmalıdır. Bu cinsin son taksonomik tanımında (Van Der Plaatz-Niterink, 1981)  87 tür listelenmektedir; Daha sonra ilave türlerin tanımı ile bu toplam 120 ye çıkmıştır (Dick, 1990).

Pythium’ da hifler şeffaftır ve 5-7 mm çapta (ara sıra 10 mm‘ ye kadar) olma eğilimindedirler ve kültürlerin yaşlı olmaları ve spor farklılaşma noktaları hariç bölme içermezler. Cins içindeki türlerin ayrılmaları, asexuel ve sexuel çoğalma yapılarındaki spesifik morfolojik karakterlerin mukayesesi ile yapılır. Sporangia türe bağlı olarak değişik şekillerde (iplikimsi (flamentous), şişkin iplikimsi, küremsi (globose) ve boyutlarda oluşan asexuel sporlardır. Bu yapılar hareketli zoospore oluşumu ile doğrudan veya bir çim tüpü oluşumu ile dolaylı (in direkt) çimlenebilirler. Zoospore oluşturmayan türlerde asexuel yapılar ekseri conidia veya hyphal şişkinlikler olarak,  halbuki zoospore çıkaranlar zoosporangium olarak nitelendirilirler. Sexuel yapılar olan oospore’ lar, türler arasında çap; duvar kalınlığı; plerotic veya aplerotic oluş (oogonium’ u dolduruş); antheridium’ un  sayı, orijin ve yanaşma morfolojisi ve oogonium yüzeyinin düzgün veya dikenli oluşu ile ayrılırlar. Ek olarak, sıcaklıkla gelişme ilişkisi de yararlı bir taksonomik karakter olabilir.

Laboratuvar ortamda Sporulasyonu (Üremesi) 

Belirli bir ortam kullanıldığı zaman oospore oluşumu için C-17 sterollerin (cholesterol, stigmasterol, b-sitosterol, veya ergosterol ) 3-b-hydroxy grubu içeren, en az bir çift bağ içeren ve 8-10 yan karbon zinciri olan, eklenmesi gereklidir (Hendrix, 1974). Bu suda çözünmeyen bileşikler kültür ortamına ilave edilmeden önce etanol gibi organik bir eritende çözülmelidirler. Sexuel çoğalmanın stimülasyonu için Ca +2 varlığı da gerekli olabilir ve bu asexuel çoğalmayı da arttırır.

Çoğalma yapıları katı agar ortamlarında gözlenebilir; ancak, gözlemedeki sınırlı derinlik nedeniyle aşağıdaki teknikler daha iyi kültür materyalleri sağlayabilir.

Çim Yaprağı Kültürü: Yeni toplanmış çim yaprakları kesilir (yaklaşık 1 cm), kapalı bir beherde suya konur ve 10 dakika kaynatılır. Bu yapraklar bir petri kabındaki steril deionize suya aktarılır (Van Dert Plaatz-Niterink, 1981, eşit miktarlarda steril havuz suyu ve saf su tavsiye etmektedir). Kültürlerden bir parça bu yapraklı kaplara aktarılır ve oda sıcaklığında gün değişken ışık altında tutulur. İstenen zaman aralıklarında, yaprak örnekleri bir lam üzerine yerleştirilir ve bir mikroskop altında incelenir. Bu usul iplikimsi veya loplu sporangia içeren türler çalışıldığında tercih edilir.

Yulaf unu agar-Eğik su: 5 mg arzu edilen sterol/ml eklenmiş 2-3 ml Yulaf unu Agar (Difco) bir açı ile yerleştirilmiş 10 cm lik bir petri kabının kenarına dökülür ve katılaşması beklenir (Hancock, 1977). Soğuduğunda, ortam üzerine bir kültür aktarılır ve petri kabı kısmen steril deionize su ile (15 ml) kaplanır. İstenen zaman aralığında inkübasyondan sonra, su dökülebilir ve kültür doğrudan mikroskop altında incelenir.

Kültürler, hangi çoğalma yapılarının önemli olmasına bağlı olarak, farklı zaman aralıkları ile incelenmelidir. Genellikle, sporangia ilk olarak oluşturulan yapılardır ve ilk aktarmadan birkaç gün sonra en çok bulunan sporlardır; Bu bilhassa iplikimsi ve loplu sporangia için doğrudur. Oogonia aktarmadan 3-5 gün sonra oluşmaya başlar ve olgun oospore’ lar 4-10 gün sonra oluşur. Bazı türler için antheridial orijinin ve yaklaşım morfolojisinin yaşlı kültürlerde ayrılması güçtür; bu nedenle oogonia’ lı genç kültürler incelenmelidir. Türlere bağlı olarak, inkübasyon sıcaklığının değiştirilmesi mycelial gelişme veya sporulasyonu arttırabilir veya engelleyebilir. Şayet bakteriyel bulaşmalar olursa, su ile kaplama sırasında steril suya 100 mg/ml penicilin ilavesi kültürlerin büyüme nispeti ve morfolojisini değiştirmeden problemi en azda tutar. Kültürlerin lactophenol cotton blue ile boyanması çoğalma yapılarının gözlenmesini kolaylaştırabilir.

Zoospore çıkışının sağlanması

Zoospore çıkışının sağlanması genç kültürlerle en etkilidir. Çimen yaprağı veya yulaf unu eğik agarındaki fungal materyal 1-3 günlük olabilir. Bazı türlerde spore çıkışı kültürlerin manipulasyonu olmadan olabilir. Diğerleri için çıkış, steril su çözeltisi değiştirilerek ve/veya  4 C’ de inkübe edilerek uyarılabilir. Roberson ve Howard (1987) zoospore çıkışını çim yaprağı kültürleri ¼ güçte seyreltik tuz çözeltisinde 3 gün (Tuz çözeltisi: Stok 1, g/500 ml; (NH4)2HPO4 66.04, KH2PO4, 68.05, K2HPO4 87.09, MnCl2. 4H2O 1.80, ZnSO4. 7H20 0.44, H3BO3 2.86; Stok 2; g/250 ml; CaCl2 .2H2O 18.38, MgCl2 .6H2O 25.42.

Tam güçte bir tuz çözeltisi elde etmek için 0.5 ml Stok 1′ den ve 0.1 ml Stok 2′ den 1 L suya katılır.) geliştirildiğinde  ve tam güçte seyreltilmiş tuz çözeltisi ile yer değiştirildiğinde rapor ettiler. Alternatif olarak, V-8 sebze suyu agar kültürleri tam güçteki tuz çözeltisi ile değiştirmeden önce ¼ güçte seyreltik tuz çözeltisinde inkübe (24 sa.) edilebilir.

P. aphanidermatum ve P. ostracodes için Mitchell (1978), V-8 agar dan (koloninin kenarından) V-8 broth’ a aktarılan kültürlerin geliştirilmesi (24 sa. karanlık) ve sonra elde edilen mycelium’ un steril 0.0001 M  2-(N-morpholino) ethane-sulfonic asit (MES buffer, pH 6.2) içinde 3 kere yıkadıktan ve ışıkta (4000 lüks, 18-24 sa.) inkübe ettikten sonra etkili zoospore çıkışı elde etmiştir. Kültürler tekrar üç kere MES buffer içinde yıkanmış ve inkübe edilmiştir. Türe bağlı olarak zoospore çıkışı daha önceki işlemle 2-7 sa. içinde olmuştur.

Shishkoff (1989) P. colaratum’ dan zoospore çıkışı; izolatları 24 saat çimen yaprağı kültüründe filtre edilmiş steril olmayan toprak ekstrakta (1 g toprak 100 ml su da 24 sa. tutulduktan sonra filtre edilmiş) geliştirilmesi ve sonra saf su ile yer değiştirilmesi  ve 6 C’ de bir gece inkübe edilmesiyle elde etmiştir. Zoospore’ lar oda sıcaklığına getirildikten 10-20 dakikada çıkmıştır.

Heterothallic türlerde sexuel çaprazlama 

Bu cins içinde 7 türün heterothallic olduğu gösterilmiştir (Van Der Plaatz-Niterink, 1981); P. sylvaticum, P. heterothallicum, P. catenulatum, P. splendens, P. fleveonse, P. macrosporum ve P. intermedium. Değişen derecelerde homothallism izolatlar arasında (P. sylvaticum) olmasına rağmen farklı tipte izolatlar eşleştirilmedikçe sexuel çoğalma olmaz. Eşleşmeler CMA içeren petriler de izolatların petri kenarlarına karşılıklı olarak aşılanması ile yapılabilir. Her zaman gerekli olmamasına rağmen 5 mg/ml istenen sterol ile takviye edilmiş ortam ekseri oospore oluşumunu arttırır. Petriler 20-30 C de inkübe edilmeli ve oospore lar kültürlerin birbirine temas ettiği yerlerde aranmalıdır (en az 7 gün beklenmelidir). Hangi izolatların eşlendirilmesine olduğu kadar türe de bağlı olarak değişen miktarlarda döllenmemiş oogonia da görülebilir. Bazı tarla izolatları kendi aralarında ve bilinen heterothallic türlerle eşleştirildiklerinde oospore oluşturmazlar. Bunlar asexuel izolatlar olabilir veya Lifshitz et al (1984) ün gözlediği gibi sexuel çoğalma için daha fazla şey isteyen izolatlar olabilir.

TAKSONOMİK REFERANSLAR

Aşağıdaki referanslar cinsin taksonomisi üzerindeki tarihsel bakışı olduğu kadar son ele alışları da yansıtmaktadırlar; Matthews, 1931; Middleton, 1943; Sideris, 1932; Waterhouse, 1967; Waterhouse, 1968; Van Der Plaatz-Niterink, 1981; Dick, 1990 dir. Hendrix ve Papa (1974) tüm türleri 15 tür kompleksi içinde toplayan bir sistem önermiştir fakat bu fazla kabul görmemiştir.

Bu taksonomik referanslar morfolojik yapıların mukayesesine dayanmaktadır. Bu kriterlere ilave olarak türlerin tanısında ve akrabalık ilişkilerinin belirlenmesinde faydalı olan birkaç diğer kriter de vardır.

Seroloji: Bazı türlerin ayrılmasında eriyebilir mycelial proteinler antijen olarak kullanılmış ve elde edilen polyclonal antibody’ ler agarose double diffusion ve immunoelectrophoresis testleri kullanılarak  ayrılmaya çalışılmıştır. Son zamanlarda taksonomik amaçlı olarak monoklonal antibody ler kullanılmış ve değişik türlerin bu antibody’ lere reaksiyonları araştırılmıştır. Bu çalışmalarda türlerin akrabalık ilişkileri de cluster analizleri ile incelenmiştir. Seroloji bitkileri enfekte edebilen türlerin ayrılmasında da kullanılmıştır.

Hücresel (cellular) proteinler: Nişasta gel elektroforezi kullanılarak Clare (1963) 8 türde total protein bantlarını kullanarak türler içi olmayan fakat türler arasında olan daha büyük farklılıklar bulmuştur. Adascaveg et al (1988) 6 türün buffer da eriyen proteinlerinin isoelectric focusing’ i ile benzer sonuçları bulmuştur. Ancak, Chen et al (1991) protein bantları ve izozyme analizleri ile morfolojik olarak farklı türleri ayırabildiğini, morfolojik olarak benzer türleri (P. aphanidermatum, P. deliense, P. arrhenomanes, P. graminicola) daima  ayıramadığını bulmuşlardır. Daha kapsamlı isozyme analizleri benzer sonuçlar vermiştir. Bu tekniklerin taksonomik amaçlı kullanılmalarında bazı sınırlamaların olduğu kanısına varılmıştır. İzolatlar arasında yüksek derecede tür içi varyasyon saptanmıştır. Aynı zamanda protein bantlaşmasında kültürlerin bekletilmesi de farklı sonuçlar vermiştir. Ayrıca çok sayıda protein bantının oluşu bunların analizini de güçleştirmektedir.

Moleküler taksonomi: Mitochondrial DNA (mtDNA) ve Ribosomal DNA (rDNA) yı kotlayan nuclear genlerin mukayesesi de taksonomik amaçlı olarak kullanılabilir. Türlerin çoğunun mitochondrial genomu 60-73 kb boyutlarında ve genomun % 71-83 ünü temsil eden inverted repeat içeren dairemsi bir moleküldür;  ki bu molekül büyük ve küçük tek bir birim olarak ayrılabilir. Bazı türlerde küçük belirli bölge pozisyonunda olana denk terminal uçlu lineer moleküller vardır. mtDNA nın restriction-endonuclease digestion’ ı  29 türde belirgin derecede farklı türe özgü electroforetik bantlaşma göstermiş (Martin ve Kistler, 1990); türler arası benzerlikler genellikle % 50 nin altında (ekseri < % 30) gözlenmiş, halbuki türler içi benzerlikler genellikle % 80 den büyük olmuştur. Morfolojik karakterlerin yerine kullanma düşünülmemesine rağmen mtDNA nın kesim tiplerinin mukayesesi teşhisleri güç olan izolatların sınıflandırılmasında faydalı olabilir. 

KONUKÇU SINIRI VE DAĞILIM

Bu cinsteki türlerin mutlaka bitki patojenleri olması gerekmez, bazıları mutlak saprofit, sivrisinek larva paraziti, ve birisi de memeli patojeni olarak bulunurlar. Ancak, pek çok sayıda tür bitkilerde patojen olduğu kadar fakültatif saprofitlerdir, ve dünya çapında ürünlerde ekonomik kayıplara neden olurlar. P. ultimum gibi bazı türler geniş bir konukçu sınırına ve dünya çapında dağılıma sahiptirler. P. spinosum gibi diğerleri sadece birkaç bitkide zayıf hastalandırma gücündedirler. Çıkış öncesi ve sonrası çökerten  hastalığın yaygın görünümüdür. Olgun bitkiler de saldırılabilir, kazık kök, kök uçları ve emici kök enfeksiyonları ile bitki canlılığı ve verim kısıtlanabilir. Cinsin genel bir derlemesi için Hendrix ve Campbell (1973, 1983) ve Symposium on the genus Pythium (1974)’ e başvurulmalıdır. Tür dağılımı ile ilgili bilgiler için Van der Plaatz-Niterink (1981) veya Dick ve Ali-Stayeh’ e başvurulmalıdır. Cins üzerindeki çalışma teknikleri ile ilgili ek teknikler için Schmitthener (1973) veya Mtchell ve Rayside (1986) dan yararlanılabilir.

Dört türün, P. acanthicum, P. periplocum, P. oligandrum ve P. nunn, in vitro da diğer funguslarda mycoparasitic olduğu gösterilmiştir. Bunlardan son ikisi fungal konukçu sınırı ve biyolojik savaş ajanı olarak en fazla araştırılmıştır. Hastalık kontrolünde mycoparasitism’ in rolü henüz tam olarak gösterilmiş değildir.

İZOLASYON NASIL YAPILIR ?

Konukçu Dokusundan:

Bitki dokusundan izolasyonda dokunun 30 sn yüzeysel dezenfeksiyonu (% 0.5 NaOCl) ve arkasından steril destile su ile durulanması yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Ancak, çoğu Pythium türü elde ediliş sıklığını azaltan bu uygulamaya hassastır . En iyi izolasyon; bitkinin çürük kısımlarının çıkarılması, geriye kalan kısımların musluk suyuna daldırılması ve arkasından steril saf su ile durulanması, steril havlu kağıtlarla dokunun kurutulması ve uygun bir ortamın üzerine ekilmesi ile elde edilir. Hızlı gelişen türler için Su Agar yeterlidir.  Otoklavdan sonra ortama Tergitol NPX (% 0.1) ilavesi arzu edilebilir çünkü bu madde fungusun lineer gelişmesini sınırlar. Türe bağlı olarak Tergitol NPX aynı zamanda koloni morfolojisine bağlı tanıya olanak tanır (Bottcher ve Behr, 1985). Şayet bakteriyel bulaşma bir sorun ise, penicilin (100 mg/ml) veya ampicillin (250 mg/ml) ve rifampicin (10 mg/ml) dökmeden önce ortama ilave edilebilir. Yavaş gelişen türlerin izolasyonu  (P. vexans)  şayet hızlı gelişen diğer pythiaceous olmayan funguslar  varsa güçtür bu nedenle seçici veya ayırıcı bir ortamın kullanılması önerilir. Birkaç tana kullanılan seçici ortam: Gallic Acid Ortamı (g/L olarak; sakaroz 30, NaNO3 2, MgSO4 .7H2O 0.5, KH2PO4 1.0, yeast extract 0.5, thiamine HCl  2 mg, Rose bengal 0.5. İçerik 1 L suya tamamlanır, pH’ 4.5′ e ayarlanır. 20 g agar eklenir ve otoklav edilir. Ortam 45 C’ ye soğuduğu zaman aşağıdaki maddeler ilave edilir. PCNB 25 mg, Penicilin 80.000 ünite, nystatine 100.000 ünite) MPVM Ortamı (agar 23 g, sakaroz 17 g, ZnCl2 1 mg, FeSO4 7H2O 0.02 mg, CuSO4 .5H2O 0.02 mg, MgSO4.   7 H2O 10 mg, MoO3 0.02 mg, CaCl2 10 mg, MnCl2 0.02 mg, thiamine HCl 0.1 mg. Maddeler 1 L suya atılır, otoklav edilir, 45 C’ ye soğuyunca  rose bengal 10 mg, pimaricin 5 mg, PCNB 100 mg, vancomycin 300 mg eklenir. Petriler soğuyunca karanlıkta saklanır), P10VP Ortamı (1 L otoklav edilmiş Corn Meal agar (17 g Difco CMA/L)’ a 10 mg pimaricin, 200 mg vancomycin, 100 mg PCNB eklenir), P5ARP Ortamı (P10VP ortamından farkı pimaricin 5 mg olması, 250 mg ampicillin ve 10 mg rifampicin içermesidir.) ve EANA Ortamı  (1 L otoklav edilmiş ve 45 C’ ye soğutulmuş PDA (% 2)’ ya etaconazole 17 mg, sodyum ampicillin 300 mg eklenir) dır.

Bu ortamların pek çok modifikasyonları test edilmiştir. Ali-Stayeh et al (1986) MPVM ortamını vancomycin’ i 75 mg/ml, rose bengal’ i 2.5 mg/ml ye indirerek ve penicilin (50 mg/ml) ekleyerek modifiye etmiştir. Kannawisher ve Mitchel (1978) P10VP yi vancomycin ile ampicillin (250 mg/ml) ve rifampicin (10 mg/ml) i yer değiştirerek modifiye etmişlerdir. Jeffer ve Martin (1986) daha sonra onu pimaricin‘ i 10 dan 5 mg/ml ye indirerek değiştirmiştir; yüksek pimaricin konsantrasyonu bazı türlerin oospore çimlenmelerini önleyebilir      (bu indirgenmiş konsantrasyon bitki dokularından izolasyonda gerekli olmayabilir). Lumsden et al (1976)  P. myriotylum ve P. aphanidermatum’ un gallic asit ortamında topraktan izolasyonunda iyi sonuçlar elde etmemişler fakat P. oligandrum için iyi sonuçlar elde etmişlerdir. İzolasyonlar için kullanılan en yaygın ortam P5ARP olmuştur. P. aphanidermatum ve P. oligandrum’ un türe özgü izolasyonu ve tanımı için ortamlar da geliştirilmiştir (Burr ve Stanghellini, 1973).

Bakteriyel bulaşmaları önlemek için çok değişik antibiyotikler kullanılmıştır. Vancomycin’ in pahalığı ve bakterileri önlemede sürekli olmaması ampicillin (Sodyum tuzu) ve rifampicin kullanımı arzu edilmektedir. Rifampicin stok çözeltileri  antibiyotiği önce % 95 EtOH içinde çözüp sonra su ile EtOH konsantrasyonunu      % 50 ye getirerek hazırlanılabilir. Streptomycin sulfate, kanamycin, veya tetracycline daima dikkatle kullanılmalıdır çünkü bazı türler bu antibiyotiklere hassastırlar. Pimaricin veya Rose Bengal içeren ortamlar kullanıldığında  karanlıkta saklanmalıdırlar çünkü bu bileşikler sırası ile daha fungitoxic olabilir (pimaricin ışıkta) veya etkisini kaybedebilir (Rose Bengal, ışıkta).

Topraktan: 

Tuzaklama teknikleri: Seçici ortamların geliştirilmesinden önce Pythium spp., organik maddelerle tuzaklama ile izole edilmekteydi. Enfeksiyonlu bitki dokuları durulanır ve kaynatılmış kenevir tohum yarıları veya havuç dilimleri içeren steri saf su içinde yüzdürülür; birkaç gün sonra Pythium spp. substratı kolonize eder, ve bu parçalar sonra kültür için agara aktarılır. Toprak benzer şekilde araştırılabilir. Diğer tuzaklar da kullanılmıştır. Tuzaklama teknikleri seçici ortamlarla birlikte patojenik izolatların aynı zamanda teşhislerini de yapacak şekilde tarla sürveyleri için kantitatif belirlemeler için seçici ortam miktarını azaltmak amacıyla kullanılabilir. Kronland (1985) tepe yüzeyinde su-agar blokları olan patates dilimlerini nemlendirilmiş toprak yüzeyine koyarak, sonra iki gün (27 C de) inkübe ederek ve su-agarı bloklarını seçici ortamlara aktararak  P. aphanidermatum’ u tercihen izole etmiştir.

Toprak Seyreltme Ekim Tekniği: Toprak seyreltmelerinin seçici veya ayırıcı ortamlara ekilmesi ile bir grup  türün izolasyonunu olduğu kadar kantitatif belirlenmelerini de sağlar. Hava kurusu tartılmış (< 4 g) toprak örnekleri 10 ml lik steril su içine eklenir (% 0,1 den % 0,3’ e kadar su agar da kullanılabilir) ve bir karıştırıcıda karıştırılır. Karıştırılmanın hemen arkasından, küçük bir hacim (< 0,2 ml) alınır ve 3 günlük istenen bir ortamın üzerine konur; yüzey üzerine bükük bir cam çubuk ile yayılır. Petri kapları ters vaziyette (25 C de karanlıkta) inkübe edilir; araştırılan türün sıcaklık isteğine göre daha yüksek veya düşük sıcaklıklar kullanılabilir. Kaplar   P. ultimum veya P. aphanidermatum gibi hızlı gelişen türler 24 saat sonra, P. olygandrum gibi yavaş gelişenler 72 sa. kadar geç okunur. Şayet ortamın üzerine çok miktarda toprak bırakılmışsa kolonilerin gözlenmesinden önce kapların yüzeyinin ince akan bir musluk suyu altında yıkanması gerekli olabilir. DeVay et al (1982) topraklar seyreltme yapılmadan kuru olarak incelendiğinde daha çok Pythium spp. elde ettiler. Ortamda Tergitrol NPX veya 10 mg/ml den daha yüksek pimaricin konsantrasyonları kullanımı konusunda dikkatli olunmalıdır çünkü onlar bazı türlerin oospore çimlenmesini engelleyebilirler. İnkübasyon sıcaklığının ve ortam pH’ sının değiştirilmesi topraktan elde edilişi etkileyebilir.

Toprak seyreltme ekim tekniği ile her toplama bölgesinden 3 tekrarlı olmak üzere her seyreltmeden 5 petri kabı (toplam 15 kap) kullanılmalıdır. Inokulum yoğunluğu çimlenebilir parçacık/g toprak  olarak ifade edilir ve ortalama koloni sayısı ve petri kabı başına ilave edilen toprak kullanılarak hesaplanır. Bazı türler seçici ortamlarda benzer bir gelişme tipi gösterirler, bu nedenle benzer kolonilerin hif ucu kültürleri yapılarak bunların teşhisleri doğrulanmalı ve  sayımı yapılan türün o olup olmadığı ortaya konmalıdır.

P. ultimum’ un sayısal belirlenmesi toprak-damla tekniği ile yapılabilir. Toprak örnekleri (genellikle < 6 g) 100 ml musluk suyu içinde süspansiyon yapılır ve bir karıştırıcıda en az 30 da. karıştırılır; daha sonra 1 ml alınır ve 4 agar ortamı (kabı) üzerine dağıtılır (9-12 damla / petri kabında dairemsi vaziyette). Bir gece inkübe edilir (21-26 C) ve bir stereo mikroskop altında gözlenir; hızlı gelişme oranı ve kısa yan dallardan oluşan koloniler ultimum dur. Düşük inokulum düzeyindeki topraklar analiz edilirken, bu teknik süspansiyon damlalarının agar yüzeyine dağıtılması yerine kaplardan agar diskleri çıkarılması ve bunların toprak süspansiyonu ile doldurulması şeklinde modifiye edilebilir. Kantitatif bir bioassay elde etmek için bir toprak tuzak tekniği de kullanılabilir.

İZOLATLARIN SÜRDÜRÜLMESİ VE SAKLANMASI


pythium

SÜRDÜRME- Çalışma kültürleri Bakteriyel bulaşma olmayan kültürler Su-Agar, V-8 suyu Agar, PDA veya CMA da Petri kaplarının kenarları para film ile kapatılmış olarak birkaç hafta tutulabilir. İzolatlar aktarmalar arasında tüplerde PDA eğik agarda yaklaşık 4 hafta tutulabilir. Şayet kültürler basık gelişme veya erime gösterirse penicilin (100 mgml) veya ampicillin (250 mg/ml) ve rifampicin (10 mg/ml) katılmış su agarına aktarılmalıdır.

SAKLAMA-PDA-Mineral yağ eğik agarı Kültürler pamuk veya köpük kapaklarla kapatılmış eğik PDA agar larına aktarılır, oda sıcaklığında 3-5 gün gelişmeleri sağlanır ve üstleri kaplanıncaya kadar steril mineral yağ ile kaplanır; tüpler 15-23 C arasında karanlıkta saklanır. İzolatları yeniden geliştirmek için, küçük bir miktar miselyumlu agar parçası alınır ve su agarına ekmeden önce steril bir kurutma kağıdında yağı alınır. Fungal gelişme için uygun olan sıcaklıkta inkübe edilir, kültürün gelişmesi  birkaç gün alabilir. Türlerin çoğunun bu yöntemle saklanması stabil gözükmelerine rağmen, 14 yıl depolamadan sonra P. myriotylum ve P. graminicola sporulasyon özelliklerini kaybetmişlerdir.

Suda saklama: Deionize su ve birkaç kenevir tohumu içeren lastik kenarlı vidalı kapaklı şişeler otoklav edilir (Raabe et al, 1973). Soğuduktan sonra, bir kültür ilave edilir ve gevşek şekilde kapatılır. Oda sıcaklığında 7 gün inkübe edilir ve kapak sıkı bir şekilde kapatılır, 15-25 C ler arasında karanlıkta saklanır. İzolatları yeniden geliştirmek için steril bir aktarma iğnesi ile bir parça mycelium alınır ve bir agar ortamı üzerine aktarılır. Şişeler tekrar kapatılabilir ve depolamaya tekrar konabilir, bu yolla kültürler 5 yıldan daha uzun süre saklanabilir. Bu metot Singleton (1986) tarafından modifiye edilmiştir. Burada kenevir tohumu yerine buğday (Triticum aestivum) yaprak parçaları kullanılmıştır. Diğer bazı araştırıcılar tek başına agar blokları kullanarak da başarı kaydetmişlerdir.

Crystorage (Düşük derecelerde saklama): Pythium’ ların sıvı azotta saklanması için değişik teknikler rapor edilmiştir. Bunlar; cryoprotectant’ lar olmaksızın agar kültürleri, % 8.5 kaymaksız süt ve % 10 gliserinde spor süspansiyonları, % 10 gliserin veya % 8 glikoz ve % 10 DMSO içinde mycelial veya spor süspansiyonları gibi. Tüm tekniklerde sıvı azota daldırmadan önce  –40 C’ ye kadar yavaş dondurma (1 C/da) ve cryo şişelerin 37 C deki bir su banyosuna konarak hızlı çözülmesi en iyi canlılığı elde etmiştir. Bazı türlerde canlılık oranı kültürlerin cryo şişelere aktarılmasından önce 4-7 C’ de geliştirilmesiyle arttırılmıştır.

Lyophilisation: Otoklav edilmiş nemli yulaf  (Avena sativa) saplarını 2 günlük bir agar kültürü üzerine koyun, bol miktarda oogonia oluşuncaya kadar bekletin. Yulaf saplarını taze bir kaba aktarın ve agar ortamının kenarında oogonia oluşuncaya kadar inkübe edin. Yulaf saplarını ayırın ve 1 cm lik parçalara kesin ve parçaları steril bir ampulün içine koyun. Ampulü pamuk ile tıkayın ve 3 sa. vakum altında havası alındıktan sonra ağzını kapatın. Kültürlerin önce dondurulması gerekli değildir. Kültürler yeniden geliştirileceği zaman saplar önce bir nemli bölmede 12-60 sa. tutulur sonra uygun bir agar ortamına aktarılır. Bu yolla sadece oospore oluşturan türler saklanabilir. Saklama 5-7 yıl olmuştur.

INOKULUM OLUŞTURMA VE PATOJENİSİTE TESPİTİ

Inokulum oluşturma:

Sıvı Kültür: Inokulum oluşturmak için çok değişik ortam kullanılabilir, onların tercihi istenen türe ve fungal yapıya göre değişecektir. Genel olarak besince yüksek bir ortamın (C/N oranı düşük) kullanılması mycelial oluşumu arttırır, sporulasyonu azaltır. Sporulasyonu teşvik etmek için böyle bir ortamın yıkanması ve kültür ağının steril deionize su veya  0.001 M CaCl2 içinde tutulması gerekebilir. Çok miktarda bir inokulum oluşturmak için, kültürleri birkaç petri içinde 3-5 gün geliştirin, mycelial kütleyi steril bir homojenizatörde parçalayın ve aseptik olarak yeni bir ortama ilave edin, ki bu da sonra yeni ortamlara dökülebilir. Türlerin çoğunun gelişmesi ve sporulasyonu için durgun kültürler sarsmalı kültürlerden daha iyidir.

Sporangium oluşturma: Uygun olmayan steroller olmadığı zaman olgun oospore olmayacağı için bu maddeleri içermeyen sınırlı bir ortam kullanılması sadece aseksüel çoğalma yapılarının oluşmasını sağlayacaktır. Kültür, ortam içeren bir petri kabına aktarılır ve kap tam kaplanıncaya kadar optimal bir sıcaklıkta geliştirilir.  Aseptik olarak myceliım alınır ve steril deionize su ile mycelial kütle 3 defa durulanır ve sonra steril 0.001 M CaCl2 ilave edilir. 5-7 günlük ek bir inkübasyondan sonra oogonia oluşacak fakat kalın duvarlı oospore’ lara olgunlaşmayacaktır. Şayet bakteriyel bir bulaşma sorun ise, 100 mg/ml penicilin eklenebilir.

Oospore oluşturma: Oospore oluşturmak için daha önce verilen sınırlı kimyasallardan oluşan ortamlar istenen sterol ile muamele edilir veya ½ güçte V-8 sebze suyu gibi doğal bir ortam kullanılabilir. Kullanılan türe ve ortama bağlı olarak mycelial ağın durulanması ve 0.001 M CaCl2 de inkübasyon  sporulasyonu artırır. Mycelium ve sporangia’ yı yok etmek için  kültürler birkaç yoldan biri ile muamele edilebilir. Bunlar; Sonifikasyon (160-320 watt 20 sn.) (bu uygulama bazı türler için  özellikle küremsi sporangium’ lu olanlar için, etkili değil); % 0.2 lik KMnO4 ile 20 da. muamele arkasından steril deionize su ile 3 kere durulama yuvarlak sporangium lu türlerde mycelium ve sporangium’ ları tamamıyla yok etmiştir. Değişik konsantrasyonlarda Driselase’ lerle (laminarinase, xylanase ve cellulase içeren ham enzim karışımı) muamele veya –20 C ‘ de 24-48 sa. tutma sporangia’ yı elemine etmemiştir.

Katı substrat: Katı substratlarda inokulum oluşturma değişik bitki tohumları (Pancar, turp, darı gibi) kullanılarak başarılmıştır. Tohumlar ve su (1:1, v/v) ağzı pamuk tıkaçla kapalı bir geniş ağızlı erlenmayerde karıştırılır, birbirini izleyen 2 gün otoklav edilir. Soğuduktan sonra istenen izolatın kültürü ilave edilir ve gelişme ve sporulasyon için uygun sıcaklıkta inkübe edilir. Bu inokulum 7-10 gün sonra, substrat tam olarak kolonize olduktan sonra kullanılabilir. Bu inokulum toprağa tohumlar ayrılarak tohum şeklinde veya tüm karışım bir değirmende öğütüldükten sonra karıştırılabilir. Inokulum aynı zamanda; % 3 mısır unu-kum (w/w, % 20 su eklenmiş) veya mısır unu-vermiculite (ince öğütülmüş mısır unu ve ince vermiculite, 1g/4 g) ve su (4 ml/g) veya şeffaflaştırılmış ½ güçte V-8 sebze suyu (4g/ml) de çoğaltılabilir. Türe bağlı olarak bu materyal taze veya kurutularak kullanılabilir, kurusu 15 C’ de birkaç ay saklanabilir.

Bu cinsin pek çok bitki patojeni türleri taze organik substratlarda fakültatif parazittirler, bu da onların bu gibi materyallerde çoğaltılabileceğini gösterir. Yaklaşık olarak 500 g toprak bir kaba konur ve otoklavda sterilize edilir. Beş gram, parçalanmış, yeşil yaprak dokusu eklenir, tam olarak karıştırılır ve su ile –1.0 kPa matric potansiyele getirilir. Kültür eklenir, kap kapatılır ve fungus için uygun olan sıcaklıkta 24 saatte bir karıştırılarak inkübe edilir. Karışım 7 günlük inkübasyondan sonra havada kurutulur, karıştırılır, seçici ortamlarda parçacık miktarı dilüsyon yöntemi ile belirlenir, ve kullanılacağı güne kadar 15 C’ de tutulur.

PATOJENİTE BELİRLEMELERİ: 

Belirli bir izolatın patojenitesini belirlemek için çok değişik teknikler kullanılabilir. Bunların seçimi ihtiyaç duyulan bilgiye bağlıdır. Bir izolatın bir bitkiyi enfekte edip edemeyeceğini belirlemek için agar kültürünün veya sıvı ortamdan elde edilen mycelium’ un bitki tohumunun ekileceği veya daha önce bitki gelişmesi olan toprağa eklenmesi yeterlidir. Ancak; eğer izolat virulensi veya hastalık epidemiolojisi hakkında bilgi arzu ediliyorsa, daha detaylı bir deneysel yaklaşım gerekmektedir. Bu denemelerde doğal tarla toprağının kullanılması iyi olmasına rağmen; diğer patojenlerden ari toprak bulunması güçtür. Eğer durum böyle ise; topraklar bir hava-buhar karışımı ile pastörize edilebilir (60 C, 30da.) veya yaklaşık – kPa matric potansiyele ayarlandıktan sonra mikro dalgaya maruz bırakılır, bunun süresi de toprak tipine göre değişir. Topraklar aynı zamanda otoklav edilebilir veya metil bromit veya metam sodyum ile fumige edilebilir. Metam sodyum ile fümigasyon için, 12 ml Vapam (% 33 a.m.) / l su / 15 kg toprak ilave edilir, 5 gün iyice kapatılmış plastik torbada tutulur, ve kullanımdan sonra 2 hafta havalanması sağlanır.

Sayısı belli inokulum düzeyleri ve/veya inokulumsuz geliştirme ortamı veya metabolik yan ürünler istendiğinde, sıvı ortamda geliştirilen kültürler  homojenize edilir ve ortamdaki besinlerin yıkanması için tam olarak durulandıktan sonra toprağa karıştırılır. Sıvı ortam toprak sulandıktan sonra su ile tam olarak kaplanmayacak şekilde  ayarlanmalıdır. Mycelial parçacıkların öldürülmesi için toprak birkaç gün havada kurutulur, öğütülür, iyice karıştırılır ve toprak seyreltme yöntemi ile inokulum yoğunluğu belirlenir. Türe bağlı olarak inokulum 15 C de en az birkaç ay canlılığını sürdürür. Bulaşık toprak sonra deneme toprağına istenilen inokulum düzeyini oluşturacak oranda karıştırılır. Kullanımdan önce inokulum miktarı ölçülmelidir.

Hareketli zoospore’ lar da inokulum olarak kullanılabilir, fakat onların enkist olmamasına dikkat edilir. Inokulum, küçük damlalardaki (20 ml) zoospore’ ların sayılması ve istenilen düzeyde seyreltilmesi ile  sayısal olarak belirlenir. Zoospore canlılığı, ortam üzerine süspansiyon konarak ve 24 sa. sonra ortamdaki koloniler sayılarak belirlenebilir.

Belli bitkilerin hassasiyetleri bulaşık topraklara tohum ekerek ve çıkış ve canlılık sayılarak belirlenebilir. Alternatif olarak, fideler bulaşık toprağa şaşırtılabilir ve kökleri enfekte etme yeteneği ve çıkış sonrası (post-emergence damping-off) çökertene neden olması belirlenir. Konukçu üzerindeki patojenin etkisiyle oluşan öldürücü olmayan (sub lethal) etkiler enfeksiyonlu ve sağlıklı bitkilerin kök yoğunluklarının mukayesesi ile değerlendirilebilir. Kökler aynı zamanda Tergitol NPX ile muamele edilen su agarına aktarılabilir ve patojen tarafından yapılan kök kolonizasyonu tespit edilebilir, sonuçlar  toplam kök kolonizasyonunun % si  olarak  ifade edilir. Enfeksiyonlu bitkilerin büyüme veya verim azalmaları da gözlenebilir. Tüm denemeler için Koch postulatı sağlanmalıdır.

Bu cinsin bireylerinin neden olduğu hastalıkların periyodik olarak fazla toprak rutubetini sağlayan koşullar ile ilişkili bulunmalarına rağmen, sürekli çok fazla toprak suyu hastalığı baskıda tutabilir. Sıcaklık da hastalık gelişmesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Örneğin, konukçuya bağlı olarak, P. aphanidermatum’ un neden olduğu hastalıklar 30 C’ nin üstünde arttırılabilir, P. ultimum’ un neden oldukları da 21 C’ nin üstünde. Radyal gelişme için optimum olan sıcaklık hastalık gelişmesi için optimum karşılığı olmayabilir, sıcaklık diğer toprak mikroorganizmalarını etkileyebilir veya konukçunun hassasiyeti etkilenebilir dolayısı ile de hastalık oluşumu da.

Did you find apk for android? You can find new Free Android Games and apps.
0
Hastalıklar David Andersen 1 sene 0 Cevaplar 311 görüntüleme 3

Hakkında David Andersen

Hey Dostum bitki hastalıklar hakkında pekte fena sayılmam ! ABD'de şu an da doktora çalışmalarını yürütmekteyim. Bitkiler dünyasında esrarengiz olan bakteri,fungal,virüs gibi etmenler ne denli hastalıklar yaptığı konusunda araştırmalar yapmak müthiş zevk veriyor... Takipte kalın...

Beni Takip Et

Cevap bırak