Phytophthora etmeni nedir ?

Konu
Want create site? Find Free WordPress Themes and plugins.
Phytophthora palmivora - Sporangiosporları

Phytophthora palmivora – Sporangiosporları

Genel Özellikleri:

P. infestans’ ın DeBary (1876) tarafından tanımlanmasından bu yana 80 Phytophthora türü yayımlanmasına rağmen bugün için 40 kadar tür geçerli kabul edilmektedir.


Phytophthora
türlerinin ortak özellikleri şunlardır;

  • Başlangıçta dik açılı bölmesiz hiflerin diplerinde hafif daralmalar

  • Indeterminate gelişme ile tipik olarak simpodiyal dallı sporangiophorlarda oluşan ovoid, obpyriform veya limoniform sporangium’ lar

  • Olgun, lateral iki kamçılı zoospore’ ların sporangium içinde farklılaşması

  • İnce veya hiç periplasm içermeyen tek, küremsi oospore’ lu küremsi oogonia

  • Amphyginous veya paraginous antheridia

 

Stamps et al (1990) tarafından Phytophthora  cinsi içinde aşağıdaki kriterlere göre 5 grup oluşturulmuştur.

  1. Sporangia’ nın apical kalınlaşma derecesi

  2. Çıkış deliğinin genişliği

  3. Sporangia’ nın saplılığı

  4. Sap uzunluğu

  5. Antheridia’ nın oogonia ya bağlanışı

Son yıllarda yapılan çalışmalarla tür ayırımı doğrulanmıştır. Bu çalışmaların yürütüldüğü metotlar:

  • Karyotype analizleri

  • Seroloji

  • Eriyebilir proteinlerin elektroforez ile bantlarının ayırımı

  • İsozyme analizleri

  • Mitokondrial ve nükleer DNA analizleri

Bu çalışmalarla P. nicotianae ile P. parasitica, P. arecae ile P. palmivora’ nın  conspesifik oldukları; P. melonis ile P. sinensis‘ in P. drechsleri ile sinonim oldukları saptanmıştır. Bunun aksine yine bu yeni çalışmalar  P. megasperma için oluşturulan karmaşık ve geniş tür kavramının kabul edilemeyeceği, aksine bu taksonomik kademenin birkaç yeni türe ayrılabileceği gösterilmiştir.

[box type=”warning”] Burdan Sonra ki bilgiler üst seviye bilgilerdir. Konuya hakim olmayanlar için ağır gelebilir. Tavsiye edilen: Y.lisans – Doktora öğrencileri ve Akademik personel düzeyindekiler için uygundur.[/box]

SPORULASYON (Üremesi) ve çoğaltma yöntemleri:

Pek çok Phytophthora türü; Lima fasulyesi agar veya V-8 juice agar veya broth gibi yaygın ortamlarda, sentetik ortamlarda, bitki parçalarında (Steril suda kenevir tohumları gibi), sporangium oluşturur. Sexuel ve asexuel sporların oluşumu ve fonksiyonelliği için  dışardan sterol ilavesi gerekmektedir. Sterol eksikliği olan ortamlara bu nedenle cholesterol, b-sitosterol, veya diğer C-17 sterollerin birisi 10-30 mg/L ilave edilmelidir. Phytophthora türüne bağlı olarak, sporangium oluşumu için kültürlerin su altında bırakılması veya broth kültürlerden mycelial kitlenin  steril su altında tutulması gerekmektedir. Ek olarak bazı türler, P. cinnamomi gibi, mineral tuz çözeltisi veya steril olmayan toprak ekstrası gibi ekstralarla muamele edilmediği zaman sporangium oluşturmazlar.

Sporangium oluşumu; Uygun havalanmaya bağlıdır ve tür ihtiyaçlarına göre NUV sınırlarında ışık ile artırılır, engellenir veya etkilenmez. Sporangia geniş bir sıcaklık sınırı içinde oluşur fakat optimum oluşum dar bir sınır içinde olur. Türlerin çoğu yeterli sayıda sporangium’ u tanıya olanak verecek şekilde 25 C’ de 2-7 günde oluşturur. Sporangia zoospore oluşturmaya yıkanmış ve yeniden süspansiyon yapılmış kültürlerin su ile birlikte 10 C’ de 15-30 da. üşütülmesi ile zorlanır. Zoospore’ ların sporangium içinde farklılaşması Phytophthora’ nın Pythium’ dan ayrılmasına yardımcı olur.  Pythium zoospore’ ları oluşan bir vesicle içine akan stoplasmadan farklılaşır.

Asexuel, kalın veya ince duvarlı, küremsi yapılar olan chlamydospore’ lar bazı Phytophthora türlerinde yaygın veya sentetik ortamlarda veya enfeksiyonlu bitki kısımlarında hemen oluşurlar. Sporangium oluşumunun aksine chlamydospore oluşumu berraklaştırılmış V-8 gibi bir besince zengin ortamlarda teşvik edilir. Ortamın karbon/azot oranı  ve sterollerin ilavesi spor oluşumunu kuvvetli derecede etkileyebilir, fakat chlamydospore’ lar geniş bir sıcaklık, pH, ve ışık sınırında oluşturulur.

Oospore’ lar homothallic Phytophthora türlerinin kendilenmesi ile, heterothallik türlerde ise uyuşan tür içi eşleştirmelerle elde edilir. Ek olarak, heterothallik türlerde uyuşan tiplerin bulunması halinde kendileme ile veya homothallic türlerde kendileme ile oospore oluşu  için kimyasal bir stimülasyona gerek vardır. Uyuşabilirlik testi, bilinen farklı tiplerle elde mevcut tipin test edilmesi ile anlaşılır.

Homothallic türlere örnekler;

  • Paraginous antheridia içerenler cactorum, P. citricola, P. lateralis, P. megasperma, P. porri, P. sojae, P. syringae,

  • Amphiginous antheridia içerenler boehmeriae, P. erythroseptica, P. fragaria, P. hevea, P. hibernalis, P. ilicis, P. phaseoli ve P. richardiae

Heterothallic türler amphyginous antheridia içerirler.

Bunlara örnekler: P. infestans, P. arecaeP. cambivora, P. capsici, P. cryptogea, P. drechsleri, P. meadii, P. mexicana, P. palmivora, P. nicotianae.

Farklı  pek çok türün uyuşan test izolatı American Type Culture Collection (ATCC) ve Zentmyer Culture Collection’ dan elde edilebilir.

Eğer izolatların oospore’ ları homothallic olarak uygun ortamlarda (V-8 agar, Lima bean agar gibi) oluşturulmaz ise bu türün veya yakın türlerin uyuşan türleri ile eşleştirilerek oluşturulmalıdır. Steroller ve yüksek C/N oranı (ortama kalsiyum eklenerek), oluşumu arttırır. Oospore oluşumu için kültürler 18-20 C’ de karanlıkta tutulmalıdır. Işık oluşumu engelleyebilir.

Aşağıdaki agar disk sandwich tekniği ile pek çok Phytophthora eşleşmesi çabuk ve etkili bir şekilde yapılabilir.

  • Önce her uyuşan tipin V-8 agarda geliştirilen 2 günlük kültüründen 1 cm çaplı diskleri steril bir petri kabına aseptic olarak aktarılır

  • Her bir mycelial disk üzerine aşılanmamış temiz bir kültür diski konur

  • Test edilecek her bir izolat için bir mycelial disk daha önce hazırlanmış olan iki üst üste konan mycelial disk üzerine konur, böylelikle her izolat iki ayrı tip ile de testlenmiş olsun

  • Petri kabı para film ile çevrilir ve kültürler 20 C’ de karanlıkta inkübe edilir.

  • 4-8 gün sonra agar diskleri ayrılır ve oospore varlığı agarda mikroskobik olarak araştırılır

 

KONUKÇU SINIRI VE DAĞILIMI

Dokuz tür aquatic ve saprofitiktir, fakat türlerin diğerleri farklı tohumlu bitki patojenidirler ve dağılımları dünya çapındadır.

Pek çok önemli Phytophthora türünün coğrafi dağılışı ve konukçuları CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria’ da bulunabilir.

Bazı türler farklı familyalarda yüzlerce bitki türüne saldırırlar; P. cinnamomi ve P. palmivora gibi

Bazı türler ise birkaç konukçuya sınırlıdırlar; P. infestans ve P. clandestina gibi.

Elma, Kakao, Kiraz, Domates ve birkaç diğer konukçu her biri 5 veya daha fazla Phytophthora türü tarafından saldırılır.

Büyük epidemilere yol açan türlere örnekler; Patateste P. infestans,  Avustralya doğal ormanlarında  P. cinnamomi, Taro’ da P. colocasiae, Elmada P. syringae, Cacao’ da birkaç Phytophthora.

Phytophthora spp. fidelerde çökerten, kök ve yumru çürüklüğü, Kök boğazı ve gövde kanserleri, Solgunluk, yaprak yanıklığı ve meyve çürüklüğü hastalıklarına yol açar.

İZOLASYON NASIL YAPILIR ?

Konukçu Dokusundan İzolasyon Alma: 

Değişik seçici ortamlar Phytophthora spp.’ nin kök, gövde, dal veya meyvelerinin aktif olarak ilerleyen lekelerinden iyi seçilmiş yıkanmış kök, yaprak ve küçük bitki dokularından izolasyonuna olanak tanır. Seçici ortamlar kullanıldığında enfeksiyonlu materyalin yüzey dezenfeksiyonuna genellikle gerek yoktur. Fakat gerekirse % 0.525 NaOCl de 0.5-3 da. veya % 70 etanol da 15-30 sn uygulanabilir.

Tsao tarafından geliştirilen PVP ortamı ve onun modifikasyonları bir çok Phytophthora türünün bitki dokusundan ve topraktan izolasyonunda geniş çapta kullanılmıştır. Yaygın olarak kullanılan seçici bir ortam PAR (g/L olarak; Difco Corn Meal agar 17,  1 litre su ile karıştırılır otoklav edilir. Ortam 45 C’ ye soğutulur ve aşağıdaki antibiyotikler ilave edilir. A.m. olarak; pimaricin 10 mg, ampicillin 250 mg, rifampicin 10 mg. Topraktan veya köklerden izolasyonlarda modifiye PAR ortamı olan PARPH kullanılır. Burada pimaricin 5 mg,  PCNB 100 mg, hymexazole 50 mg dir), Pytiaceae dışındaki fungusları önlemek için pimaricin, bakterileri önlemek için ampicillin+rifampicin içerir. Eğer pimaricin yok ise onun yerine daha az etkili olan nystatin (25-50 mg/L) ve benomyl (10 mg/L) kombinasyonu kullanılabilir. Bu değişimin bir versiyonu Masago ortamı (mg/L olarak; PCNB 25, Benomyl 10, Ampicillin 500, Rifampicin 10, Nystatin 25, Hymexazole 25, PDA 39 g) adıyla bilinmektedir ve P. capsici’ nin seçici izolasyonun için önerilmektedir. Bilhassa köklerde bulunan Pythium ve Mortierella türleri yavaş gelişen Phytophthora kolonilerini kaplayabilir ve bunu önlemek için PAR ortamına 50 mg/L hymexazole katılabilir. Şayet hymexazole tüm Pythium spp.’ yi etkilemez ise o zaman iprodione (100 mg/L) eklenebilir. Bazı Phytophthora türleri 50 mg/L hymexazole dan etkilenebilir. P. cactorum, P. lateralis ve P. infestans ve bazı türler. Türlerin çoğu için izolasyon kapları 25 C‘ de karanlıkta tutulmalıdır (Pimaricin ışıkta bozulur). Fungusun gelişmesi genellikle 2-4 günde olur.

Seçici ortamlar bitki dokusundan Phytophthora izolasyonunu kolaylaştırmasına rağmen, fungus normal dezenfeksiyon teknikleri kullanılarak  ve % 2 su agar veya CMA veya LBA gibi agar ortamlarında lekelerin kenarlarından izole edilebilir. Fungusun engelleyici nekrotik dokulardan izolasyonu için dokular birkaç saat akan su altında tutulmalı ve sonra ekim yapılmalıdır.

Topraktan izolasyon alma:

Phytophthora türleri toprakta, bilhassa hastalıklı bitkinin rhizosphaeri dışındaki toprakta, düşük konsantrasyonlarda bulunduğu için hızlı gelişen pek çok fungusu elemine eden seçici ortamların geliştirilmesi bu fungusların topraktan izolasyonunu ve fungal parçacıkların kantitatif olarak belirlenmesini mümkün kılmıştır. Topraktaki Phytophthora  miktarını kantitatif olarak belirlemek için genellikle Dilution (seyreltme) tekniği kullanılmaktadır. Topraktaki dağılmanın üniform olmaması ve konsantrasyonun düşük olması nedeniyle bu fungusların izolasyonunda ya çok düşük seyreltmeler ya da çok toprak kullanılmaktadır  (> 10 g /örnek).

Seyreltilmiş agarda (2.5 g Difco Bacto Agar/L deionize su, otoklav edilmiş ve kullanımdan önce oda sıcaklığına soğutulmuş) 1:2 ila 1:10 (w/v) toprak seyreltmeleri topraktaki Phytophthora  spp.’ nin Coloni Forming Unit olarak populasyonlarının ilk belirlemelerinde tavsiye edilmektedir. Seyreltmeler için su yerine seyreltik agar kullanılmaktadır çünkü örnekler onun içinde daha iyi süspanse olmaktadır ve parçacıklar agar yüzeyinde daha iyi asılı kalmaktadır ve böylelikle oluşacak bireysel koloniler daha çabuk ayrılabileceklerdir. Birer ml’ lik toprak-agar seyreltmesi modifiye edilmiş PAR ortamı, PARPH içeren 10 petri kabına konur.

Bir cam çubuk ile örnekler agar ortamı üzerine düzgün olarak dağıtılabilir. Karanlıkta, yaklaşık 25 C’ de 2-4 gün inkübasyondan sonra agar ortamı üzerindeki toprak-agar süspansiyonu ince bir çeşme akıntısı ile yıkanabilir ve koloniler gözlenebilir. Mycelium’ lu agar diskleri kolonilerin kenarlarından alınarak taze seçici agar ortamı içeren yeni petri kaplarına konur. Elde edilen kolonilerin kenarlarından alınan hif uçları  genellikle bulaşmalardan ari dir ve teşhis ve saklama ortamlarına oradan aktarılabilirler. Çok düşük Phytophthora  spp. yoğunluğu bulunduğunda, küçük toprak parçacıkları veya kümeleri agar ortamının üzerine doğrudan ekilebilir. Phytophthora spp.’ nin izolasyonlarında seçici ortamlar bazı araştırıcılar tarafından derlenmiştir.

Seçici ortamlar bulunmadığı zaman veya etkili olmadığında Bitki Doku Tuzakları Phytophthora spp.’ yi izole etmede kullanılabilir. Pek çok farklı tuzaklar ve tuzaklama teknikleri kullanılmaktadır. Bir tuzak olarak kullanmada bitki materyalinin tespitinde aşağıdaki durumlar düşünülmelidir; Her an bulunulabilirliği, farklı Phytophthora spp.’ ye duyarlılığı, fungusun düşük inokulum düzeylerine duyarlılığı, deneyin ve fungusun izolasyonu için kolaylığı.

Avokado (Persea americana), elma ve Citrus meyveleri yaygın olarak kullanılan tuzaklardır. Meyveler bir kapta su ile toprak seviyesinden birkaç cm yukarıda olacak şekilde doyurulmuş olan toprağa meyve tamamen su ile kaplanmayacak şekilde kısmen gömülür. Citrus yaprakları veya çam ibreleri gibi bitki yaprakları ve soya (Glycine max) veya yonca (Medicago sativa) gibi fideler su ile doyurulmuş toprağın (5-100 g) üzerinde birkaç gün yüzdürülebilir. Bu işlemler için Deionize veya saf su veya yüksek oranlarda bakır veya klor iyonu içermeyen diğer bir su kaynağı kullanılmalıdır.

Elma, kavun veya diğer büyük meyveler Phytophthora spp.’ nin izolasyonu için bir parça nemli toprağın meyvelerde açılan deliklere konması ve deliğin teyple kapatılması şeklinde kullanılabilir. Tuzaklar gece ve gündüzü taklit etmek için değişken ışıklı ve karanlık (12 saat ışık 12 saat karanlık)  ve 28 ve 20 C değişken sıcaklıklarda 3-10 gün inkübe edilmelidirler. Büyük tuzakların kahverengileşen kısımları ile sağlam kısımlarını içeren parçalar, küçük tuzak parçaların tamamı Phytophthora spp. izolasyonu için ortamlara aktarılabilir. İzolasyon için seçici ortamlar kullanılmalıdır. Çünkü Pythium spp. ve bakteriler Phytophthora spp.’ nin tuzaklardan izolasyonunu etkileyebilir.

 

İZOLATLAR NASIL SAKLANIR VE NASIL SÜRDÜRÜLÜR ?

Phytophthora spp.’ nin izolatları yaygın olarak Mısır Unu, V-8 suyu, Lima Fasulyesi veya Patates Dekstroz Agar gibi ortamlarda sürdürülebilir. Onlar seri aktarmalarla veya eğik agar kültürlerinin 6-12 C’ de bir katman steril mineral yağ altında  bir yıl veya daha uzun süre saklanabilirler. İzolatlar genellikle virulansı kaybetmeden iyi saklanırlar fakat kültürlerde saklanan streynler de virulans kaybı veya genetik dejenerasyonlar rapor edilmiştir.

Pek çok türün kültürleri sıvı azotta dondurularak büyümeyen bir  şekilde sürdürülebilir. Programlanabilir bir dondurucu olmadığı zaman, aşamalı dondurma pahalı olmayan bir dondurucuda elde edilebilir veya –80 C lik bir dondurucu kullanılabilir. Birkaç Phytophthora izolatının mycelium ile birlikte agar disklerinin 1 ml cryprotectant (% 10 gliserin veya % 5 dimetilsulfoksit) içinde propilen kavanozlarda sıvı azota konmadan önce  –80 C derecede mekanik bir soğutucuda 60 da. tutulması ile sağlanabileceği bulunmuştur. Pek çok izolatın kültürleri American Type Culture Collection kuruluşunda bu şekilde saklanmaktadır.

İNOKULUM OLUŞTURMA VE PATOJENİSİTE TESPİTİ NASIL YAPILIR ?

İnokulum oluşturma 

Pek çok Phytophthora türünün spor formu ve fonksiyonelliğinde ki değişimden dolayı inokulum oluşturma için değişen karmaşalıkta inokulum oluşturma metotları vardır. Riberio (1978) mycelia, sporangia, zoospore, chlamydospore ve oospore oluşumu için pek çok tekniği sıralamıştır. Yaygın olarak kullanılan bazı metotlar aşağıda sunulmaktadır.

Farklı Phytophthora  spp.’ nin suda otoklav edilen tohumlarda veya tuz çözeltilerinde ve sentetik ortamlarda kolaylıkla sporangia oluşturmasına rağmen; çok sayıda sporangia ve bunun sonucunda zoospore pek çok tür için sebze sularında hızlı gelişme sağlayan ve bunu takiben su veya tuz çözeltileri ile yıkanmasını içeren tekniklerle elde edilebilir. P. capsici, P. nicotianae ve P. palmivora  ve diğer türlerin  sporangia’ sı  V-8 suyunda 24-48 sa. geliştirildikten sonra 3 kez su ile yıkanarak ve 25 C’ de ışıkta sığ bir steril saf su katmanı içinde inkübe edilerek bol miktarda elde edilebilir. Saf su otoklav edilmiş  1 N KOH ile pH’ sı 6.2 ye ayarlanmış 10–4 M 2-(N morpholino)–ethane-sulfonic acid (MES) ile yer değiştirilebilir. P. cinnamomi gibi diğer bazı türlerin orta derecede bile sporangium’ u bu metotla oluşmaz, ta ki genç kültürler belirli tuz çözeltileri ile çok kereler yıkanmadığı sürece. Bazı türler bu tekniklerle çok sporangium oluşturmazlar, fakat P. cryptogea örneğin, V-8 agarda geliştirilen 7 günlük kültürlerin  steril, deionize su ile kaplandıktan sonra 25 C’ de ışıkta 7 gün daha inkübe edilmesi ile bol miktarda sporangium oluşturur.

Sporangia yıkanmış mycelium kütlesini su veya MES içinde 5-10 C de 15-30 da. tuttuktan sonra kültürleri 25 C’ de 1 saat tutarak zoospore çıkışına zorlanabilir. Eğer hareketli zoospore’ lar kullanılacak ise  zoospore’ ların hızlı encyst olmasını engellemek için fazla karıştırma, mekanik şok ve ekstrem sıcaklık değişimlerinden sakınılmalıdır.

V-8 sebze suyu veya Lima fasulyesi suyunda 2-4 hafta geliştirildiklerinde P. cinnamomi, P. nicotianaeP. palmivora ve birkaç diğer türün mycelial kütlelerinde büyük miktarlarda chlamydospore oluşturulur. Chlamydospore’ lar sentetik sıvı veya agar ortamlarında  ve in-vitro’ da geliştirilen bitki gövde veya köklerinde de oluşturulabilir. Bazı türlerde bol miktarda chlamydospore  oluşumu besin seyreltmeleri veya değişimleri ile teşvik edilir. Canlı mycelium parçaları, zoospore veya sporangia sız  chlamydospore süspansiyonları aşağıdaki yöntemle elde edilebilir: Residiyel besinleri uzaklaştırmak için mycelial kütleler yıkanır, mycelial kütle iki kere 30 sn süreyle her defasında 25 ml steril saf su ile bir blender da parçalanır, elde edilen süspansiyon bir cam-doku parçalayıcısında homojenize edilir, süspansiyon iki kat tülbentten süzülür (mycelial parçaları ayırmak için santrifüjleme gerekebilir), ve bir buz banyosunda soğutulan süspansiyon ses dalgaları ile muamele edilir. Bir Bronsonic 1510 veya eşdeğeri bir sonikatör de maksimum wattajının %60’ında 30 sn tutulursa diğer canlı materyallerin olmadığı canlı chlamydospore’ lar elde edilir.

Homothallic ve heterothallic  Phytophthora  türlerinin oospore inokulumu V-8 suyu, Lima bean broth veya sentetik ortamlarda elde edilmiştir. Anında oospore oluşturmayan izolatlar onları V-8 suyu agara 30 mg b-sitosterol, 20 mg tryptophan, 1 mg thiamine HCl ve 100 mg CaCl2. 2 H2O/l eklenerek elde edilebilir. Kültürde oluşturulması güç olan P. fragaria gibi türlerin oospore ları enfeksiyonlu köklerin yıkanmasından sonra parçalanması ve süzülmesi ile elde edilebilir. Heterothallic türlerin zıt uyuşan tiplerinin kombinasyon kültürleri; her uyuşan tipin kültürleri kültür ortamı içeren petri kaplarında ayrı ayrı geliştirildikten sonra birlikte homojenize edilip yeni ortamı inoküle etmek üzere kullanıldıklarında bol miktarda oospore oluştururlar. Zaman içinde olgun oospore’ lar daki çekirdek kaynaşmaları yüksek düzeyde oospore çimlenmesi ile orantılı olduğu için kültürler en az 3-4 hafta inkübe edilmelidir.

Oospore’ lar mycelial yığınlardan yukarıda chlamydospore’ larda bahsedildiği gibi sonication ile veya soğutma (-7 C’ de 2 sa.) veya helicase gibi enzimlerle muamele edilerek elde edilebilirler. Homothallic Phytophthora türleri  oospore’ larının patojenitede kullanılabilecekleri gösterilmiş olmasına rağmen P. capsici  ayrı tiplerin seçilmesi ile elde edilen oospore’ların inokulum olarak kullanılabileceği gösterilen tek türdür.

Spesifik spor formlarını veya inokulum miktarını istenmiyorsa inokulum broth veya agar kültürlerinde veya otoklav edilmiş tohumlarda çoğaltılabilir. Cin darı (Pennisetum glaucum) veya buğday (Triticum aestivum) tohumları örneğin, eşit miktarda su ile bir gece ıslatılır, suyu akıtılır, birbirini izleyen 2 gün sterilize edilir, patojen ile inoküle edilir ve 25 C’ de veya patojen için uygun optimum sıcaklıkta  2-3 hafta inkübe edilir.

Patojenite testleri nasıl yapılır ?

Değişik patojenite testlerin için inokulum tipinin seçiminde istenen kantitenin doğruluğu dikkate alınmalıdır ve mümkün ise normal koşullardaki hastalık durumunda fonksiyonel olan inokulum şekli taklit edilmelidir. Ara inokulum formları, sporangia ve zoospore gibi veya residiyel inokulum formlarının, chlamydospore veya oospore gibi, epidemiyolojik rollerini canlandırmak için kritik olarak belirlenmiş yöntemler arzu edilebilir. Ancak pek çok konukçunun fide, yaprak, gövde, kök boğazı, kök ve meyvelerinde izolatların patojenitesini  belirlemek için basit ve hızlı yöntemler vardır. Koch hipotezi tüm tespitlerde sağlanmalıdır.

Çıkış öncesi veya çıkış sonrası çökerten yapay olarak bulaştırılmış topraklara tohum ekilerek belirlenebilir. Aksenik broth kültürlerde, tohum üzerinde veya hassas konukçuların enfeksiyonlu köklerinde geliştirilen  Phytophthora spp. küçük parçalara ayrılır, steril toprak veya kum ile karıştırılabilir ve toprağa veya Phytophthora spp. bulunmayan dikim materyaline ölçülebilen miktarlarda ağırlık veya hacim olarak eklenir. Şayet patojensiz ham topraklar bulunamaz ise, toprak mikro dalga fırını ile sterilize edilebilir, iki gün üst üste otoklav edilebilir, veya metil bromit veya metam sodyum ile fumige edilebilir. Rutin patojenisite testleri bulaşık topraklarda belirlenmemiş inokulum düzeylerinde yapılmasına rağmen şayet bulaşık topraklardaki inokulum düzeyleri seçici bir ortam ile önceden belirlenir ise fungal populasyonların doğal koşullardakine eşit düzeylere manipulasyonu mümkündür. Sera veya iklim odaları testlerinde bulaşık topraklardaki populasyon istenen düzeylere; enfeksiyonlu toprağın seçici bir ortam ile testi ile toprağın bulaşık olmayan toprak ile seyreltilmesi, populasyonun stabilizasyonu için 2  hafta veya daha uzun sürelerde bekletilmesi ve toprağın son inokulum düzeyinin seçici ortamlarla belirlenmesi ile ayarlanabilir. Patojenite fide enfeksiyonu çıkışı, hastalık veya ölümün değerlendirilmesi ile belirlenir. Ancak bir bitkinin enfeksiyonlu olduğunun tespiti onun hasta olduğunu doğrulamaz; P. cinnamomi örneğin mısır ve daha konukçusu olmayan diğer bitkilerden izole edilmiştir fakat o  bitkilerde hastalığa neden olmamıştır.

Fide veya küçük bitki parçaları ile patojenite testleri belirli sayıda chlamydospore, oospore, sporangia veya zoospore ile yapay olarak bulaştırılmış topraklarda yürütülebilir. Bu spor formlarının hepsi bir haemocytometer ile veya mikro-drop yöntemi ile belirlenebilir. Hareketli zoospore süspansiyonları ile uğraşılırken, küçük miktarda örnekler test tüplerine aktarılabilir ve bir vortex karıştırıcı ile 30 sn. muamele edilir böylelikle zoospore’ ların encyst olası teşvik edilir bu da sayımı kolaylaştır. Seyreltmeler böylece ekimden önce toprağı nemlendirecek şekilde yapılır. Sporların canlılığı, sayımların ve seyreltme işleminin doğruluğu; spor süspansiyonları veya enfekteli toprak örnekleri seçici ortamlara ekilerek kontrol edilebilir. Zoospore’ ların; süspansiyonlara kök daldırılması ve süspansiyonların direkt toprağa  ilavesi şeklinde kullanılmasına rağmen bu sporların toprak kökenli hastalıklarda doğal inokulum olarak rolleri zoospore süspansiyonlarının su altında bırakılmış topraklara ilavesi ile daha iyi taklit edilmiş olur. Su altında bırakılmış toprağa zoospore’ ların ilavesinden sonra toprak  birkaç saat gövde veya kök boğazının maruz kalması için aynı durumda tutulur arkasından bulaşık su yavaşça drene edilerek  bitki köklerinin inokuluma maruz kalması sağlanır.

Burada tartışılan metotların biri ile inoküle edilmiş topraklar kök veya kök boğazı çürüklüğü ile değerlendirilerek patojenite testleri için kullanılabilir. Bitkiler ekseri serada veya tarlada birkaç hafta veya ay tutulmalıdır. Toprakta bitkide strese yol açan düşük oksijen düzeyleri, ekstrem sıcaklıklar, kuraklık, su altında kalma veya diğer faktörler, yonca, elma, avokado, kiraz, citrus, çam, domates ve bir çok konukçuda hastalık etkileşimini  teşvik etmek için uygulanabilir. Genel bir uygulama olarak, toprak, kum veya toprak karışımında  doğal olarak yerleşmiş veya yapay olarak bulaştırılmış odunsu bitkiler toprak yüzeyinde kalıcı su oluşturmak için 2 hafta ara ile 48 saat su altında tutulurlar. Deneyler sonunda, bitki zararı kök veya sürgün ağırlıkları alınarak ve kök veya kök boğazı hastalığının değerlendirilmesi ile belirlenebilir. Kökler genellikle hastalık değerlendirilmesi için yüzde ölüm veya lekelerin çıkışı veya şiddeti veya köklerin çürüyen kütlesinin gözle görülebilen kısmı için geliştirilen bir indekse bağlı derecelendirme ile   değerlendirilir. Verilen Phytophthora türünün etmen olduğunun belirlenmesi için kök veya kök boğazından seçici ortamlarda izolasyonlar yapılmalıdır.

Değişik bitki organları spesifik spor süspansiyonları, agar veya broth kültür parçaları, bulaşık bitki parçaları veya bulaşık toprakla inoküle edilebilir. Agar kültürlerinden kesilen diskler yaprak, gövde, meyve ve köklerde açılmış yaraların içine veya yaralanmamış yüzeylerin üstüne konabilir; sonuçta patojenite oluşan lekelerin boyutları ile ölçülebilir. Zoospore süspansiyonları ekseri doğrudan bitkiler üzerine veya koparılmış meyveler üzerine püskürtülebilir ve leke boyutları ölçülebilir. Kök hastalıklarının kritik mukayeseli testleri için konukçular damlasında 5-20 zoospore içeren 1-10 ml damlaların zararlanmamış kök uçlarına konarak inoküle edilebilir; hastalık oluşan lekenin uzunluğu veya alanı ölçülerek  değerlendirilir.

Konukçu dokusunda Phytophthora spp. nin tespiti veya konukçu dokusu içindeki hastalık veya patojenin kantitesinin belirlenmesi için son zamanlarda daha ileri teknikler geliştirilmiştir. Buna örnekler; çilek kökleri içinde P. fragaria  streynlerinin belirlenmesi, patates yaprak dokularında P. infestans mycelium’ unun belirlenmesi ve miktarının ortaya konmasında ELISA kullanımı; P. cinnamomi izolatlarının veya Phytophthora spp. nin ayrılması için spesifik monoklonal antibody problarının belirlenmesi; domates yaprak dokusu içinde P. parasitica nın tespiti için türe özgü DNA problarının kullanımı sayılabilir. Cins içinde geniş spektrumlu duyarlılığı ile zaman tasarrufu sağlayan ticari kit olarak geliştirilmiş mono klonal antibody‘ ye dayalı immuno assayler son zamanlarda birkaç türle ve konukçuyla etkililik ve duyarlılık bakımından test edilmiştir. Böylelikle bitki dokusu veya toprakta Phytophthora spp. nin tespiti ve sayısal belirlenmesi için türlere özgü birkaç metot yoldadır.

 

Did you find apk for android? You can find new Free Android Games and apps.
1
Genel Bilgiler David Andersen 1 sene 0 Cevaplar 388 görüntüleme 3

Hakkında David Andersen

Hey Dostum bitki hastalıklar hakkında pekte fena sayılmam ! ABD'de şu an da doktora çalışmalarını yürütmekteyim. Bitkiler dünyasında esrarengiz olan bakteri,fungal,virüs gibi etmenler ne denli hastalıklar yaptığı konusunda araştırmalar yapmak müthiş zevk veriyor... Takipte kalın...

Beni Takip Et

Cevap bırak